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Cas9核酸酶(D10A突变，含核定位信号)是表达纯化获得的一种含核定位信号(NLS)，能在gRNA引导下序列特异性地切割单链DNA的核酸内切酶的D10A突变体。

Cas9 Nickase(D10A,NLS)是通过对Cas9核酸酶的RuvC结构域内的单个氨基酸突变产生的D10A突变体。与野生型的Cas9核酸酶一样，Cas9 Nickase(D10A,NLS)利用gRNA靶向目标DNA序列，但是与切割双链的野生型不同，由于RuvC结构域的突变，Cas9 Nickase(D10A,NLS)仅仅切割与gRNA互补的DNA链(图1)。

图1．Cas9核酸酶(D10A突变，含核定位信号)基因编辑示意图。

• 本制品脱靶率低，特异性强。在基因编辑时需要两条gRNA靶向定位(相距范围一般在0～20bp)，双链切割后产生5'末端，易于进行同源重组，极大地降低了脱靶效应，使得基因编辑的特异性增强，避免后续实验中由于非特异性编辑产生的负面影响。
  
• 有核定位序列，编辑效率高。Cas9 Nickase(D10A,NLS)在蛋白的N端和C端都含有SV40 T抗原的核定位序列(NLS)，使Cas9 Nickase与gRNA形成的复合物在转染进入细胞后能迅速地从细胞质进入到细胞核内，从而大大地提高了基因编辑的效率。Cas9 Nickase可以通过显微注射、电穿孔和脂质体介导等方法进入细胞，而这种不需要使用DNA的系统不会产生外源DNA整合至细胞基因组的风险。

体外筛选高效、特异性gRNA；与两种特定gRNA结合后利用电穿孔或者显微注射进行体内的基因编辑。


通过E.coli重组、表达、纯化而获得，表达基因来源于Streptococcus pyogenes。

组分	100pmol	500pmol
Cas9 Nickase(D10A,NLS,1μM)	100μL	-
Cas9 Nickase(D10A,NLS,20μM)	-	25μL
10×Cas9 Nickase Reaction Buffer	0.5mL	2mL

保存：-20℃，避免反复冻融，有效期1年。


10mM Tris，300mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，50% (v/v) Glycerol，pH7.4@25℃。


10×Cas9 Nickase Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl，1M NaCl，100mM MgCl₂，1mg/mL BSA，pH7.9@25℃。


1μM (160ng/μL)；20μM (3.2μg/μL)。


SDS-PAGE电泳后纯度≥95%，不含DNA外切酶，不含非gRNA依赖的DNA内切酶，不含RNA酶，不含磷脂酶。

• 本制品使用时会涉及gRNA和DNA的操作，必须注意RNase-free和DNase-free的相关操作。所有自行准备的试剂和耗材也都应是Nuclease-free的。如果可能有核酸酶污染，可考虑用0.01%的DEPC处理过夜，然后高温高压处理后使用。操作时建议戴一次性口罩操作。
  
• 对于操作环境中核酸酶的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂以去除实验桌、仪器设备等表面或其它接触面上的核酸酶。反应体系中推荐加入RNase Inhibitor以保护RNA不被降解。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

图2．Cas9核酸酶(D10A突变，含核定位信号)体外酶活检测的效果图。反应体系：20μL水、3μL 10×Cas9 Nickase Reaction Buffer、3μL 300nM gRNA (Target sequence:5'-GGTTAATGTCATGATAATAA-3')、1μL Cas9 Nickase(D10A,NLS) (分别为1/16、1/4、1pmol)，25℃预孵育10分钟。然后加入3μL 30nM的pUCm-T载体，37℃孵育15分钟；然后加入1μL蛋白酶K，室温孵育10分钟以终止反应；最后加入6μL 6×DNA上样缓冲液，进行电泳检测。gRNA与Cas9 Nickase结合后，引导后者至pUCm-T与gRNA互补的序列互补的序列酶切产生缺刻，致使质粒形成开环，而野生型的Cas9会使质粒发生线性化。如图2所示，本制品与N公司的Cas9 Nickase(D10A,NLS)具有相当的酶活性。实际检测效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

• Cas9 Nickase(D10A,NLS)体外消化DNA。
  
  • 融解并混匀体外消化反应所需的各种溶液。将Cas9 Nickase(D10A,NLS)、gRNA、底物DNA置于冰浴上，使用无核酸酶水稀释gRNA至300nM，底物DNA至30nM。用无核酸酶水稀释适量10×Cas9 Nickase Reaction Buffer至1×Cas9 Nickase Reaction Buffer。20μM的Cas9 Nickase(D10A,NLS)推荐使用1×Cas9 Nickase Reaction Buffer稀释适量至1μM备用，稀释后宜尽快使用，不宜冻存后使用，以避免反复冻融导致酶活性下降。无核酸酶水推荐使用Ultrapure Water (DNase/RNase-Free,Sterile)。
    
  • 按照下表配制反应体系。
    

    成分	用量
    超纯水(DNase/RNase-Free)	20μL
    10×Cas9 Nickase Reaction Buffer	3μL
    gRNA (300nM)	3μL
    Cas9 Nickase(D10A,NLS,1μM)	1μL
    总体积	27μL

  • 用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。25℃预孵育10分钟。
    
  • 加入3μL 30nM底物DNA (反应体系终体积为30μL)，用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀，随后离心沉淀液体，37℃孵育15分钟，反应时间可以根据实际情况适当延长至30～120分钟。
    
  • 每个样品中加入1μL 蛋白酶K溶液，轻轻混匀，室温孵育10分钟。
    
  • 每个反应体系中加入6μL 6×DNA上样缓冲液，然后使用适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果不立即电泳，可以-20℃保存备用。通过体外的Cas9酶切实验，可以判断所设计的gRNA的效果是否理想或者优化筛选出理想的gRNA用于细胞或动物实验。
• 也可以通过适当的蛋白转染试剂把Cas9 Nickase-gRNA转染至细胞内，具体请参考相应的蛋白转染试剂的产品说明书。

• 为什么观察到目的DNA切割不完全？
  
  • 可能是由于Cas9 Nuclease、gRNA、target DNA的比例不合适引起的，推荐Cas9 Nickase、gRNA、target DNA的摩尔比例至少为10:10:1。也可以通过适当延长反应时间使反应更加充分。
    
  • 可能与gRNA的序列有关，可以根据target DNA选择更合适的gRNA序列，不同的gRNA的效果会差别比较大。
    
  • 可能由于gRNA降解引起的，可以通过凝胶电泳验证gRNA的完整性。
    
  • 反应缓冲液可能不合适，请使用Cas9 Nickase自带的缓冲液10×Cas9 Nickase Reaction Buffer。
• 为什么不同的gRNA之间的消化效率存在差异？
  
  • gRNA的序列设计可能会影响消化效率，所设计的gRNA需要进行序列与模板的验证。
    
  • gRNA的质量也可能会影响消化效率，利用琼脂糖凝胶电泳验证gRNA的完整性。
• 如何优化用于基因编辑的gRNA对？
  
  • 相比于3'突出的末端，产生5'突出的末端可以提高基因编辑的效率。利用Cas9 Nickase进行基因编辑的报道表明，当gRNA对以尾对尾(即5' - 5')的方向定向，在切割后可以产生5'突出的末端。
    
  • 控制gRNA对间隔的距离。当gRNA对的间隔在10～30bp时可以进行有效的基因编辑。重叠的gRNA对和相隔较远的gRNA对(≥40bp)也可以检测到编辑，但效率较低。建议尝试多种gRNA对，以获得最佳的编辑效率。
• 如何将酶稀释至1μM用于体外消化反应？
  
  • 如需使用较高浓度的酶体外酶切DNA，可将酶在1×Cas9 Nickase Reaction Buffer中稀释至1μM后立即使用。稀释后不能冷冻保存。
    
  • 如果1μM稀释液需要在-20℃保存，则应在反应组装前使用酶稀释溶液：10mM Tris-HCl,300mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,500μg/mL BSA,50% (v/v) Glycerol (pH7.4@25℃)进行稀释。

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